Limpieza y Montaje de Diatomeas

OBJETIVOS (Este blog forma parte de una práctica de la materia de NTIC, en la universidad de sonora)

• Familiarización con la limpieza de diatomeas para fines taxonómicos.
• Familiarización con los distintos tipos de herramientas utilizadas para el proceso de fijación de diatomeas.
• Realizar fijaciones permanentes de diatomeas.

INTRODUCCIÓN

Las muestras de protistas planctónicos, obtenidas mediante una red de arrastre, son utilizadas con fines taxonómicos. La elaboración de preparaciones permanentes o semipermanentes facilita la revisión detallada del material colectado y permite la incorporación de aquellas a herbarios o colecciones (Lara-Villa, et al., 1996).

La producción de muestras de fitoplancton permanentes en portaobjetos implica varios pasos dependiendo del método de concentración, los organismos de interés y los reactivos utilizados. Para el trabajo cualitativo, los montajes sembrados se pueden hacer simplemente pipeteando una suspensión de celdas sobre un cubreobjetos, secando y montando (Soumina, A. 1978).

El estudio detallado de la estructura de las diatomeas exige al observador, estar en posesión de los mejores medios para poder definir claramente, los menores detalles estructurales del frústulo silíceo, base para el estudio taxonómico de estos filo-organismos. Como es lógico suponer, las diatomeas no se extraen en estado de pureza al hacer las recolecciones de fitoplancton; ellas vienen acompañadas por otros organismos o restos de diversas estructuras, que, en conjunto, dificultan la observación correcta (F.C. Mûller-Melchers & Hugo J. Ferrando, 1956).

Para mejorar las condiciones de observación de los elementos morfológicos de diatomeas en el microscopio óptico, las muestras deben de: ser oxidadas para eliminar el contenido celular y el material orgánico dentro y alrededor de la cubierta externa; y montando en una resina de alto índice de refracción (G. R., Hasle, & G. A., Fryxell, 1970)

MATERIAL

•         Centrífuga.
•          Muestra de fitoplancton de red.
•          Agua desionizada.
•          Parrilla eléctrica para montaje de preparaciones/placa de calentamiento.
•          Resina sintética para montaje.
•          Solución saturada de permanganato de potasio (KMnO4).
•          Ácido clorhídrico.
•          Tubos de ensaye de 15 ml con tapa de rosca.
•          Tubos para centrífuga de 15 ml.
•          Portaobjetos.
•          Cubreobjetos.
•          Pipeta Pasteur.
•          Pinza para tubos de ensaye.
•          Lámpara de alcohol.
•          Gradilla.
•          Piseta de 500 ml.
•          Propipeta.
•          Vaso de precipitado de 250 ml.

MÉTODOS

Enjuague de la muestra y limpieza

• La muestra ya preparada con KMnO4 (proporcionada por el docente) se colocaron 2 ml en el tubo de ensaye (de 15 ml, con tapa de rosca) Figura 1:1 y se le agregó 1 ml de HCl con la propipeta Figura 1:2.
• Se sujeto el tubo de ensaye de 15 ml (tapa de rosca) con las pinzas y se calentó con la lámpara de alcohol sin llegar al punto de ebullición, hasta que se consiguió un tono amarillo claro Figura 1:3.
• Se coloco el contenido del tubo de ensaye en un tubo para centrifuga y se adiciono agua destilada hasta la marca de 15 ml.
• Se centrifugo a 2000 rpm por 3 minutos Figura 1:4.
• Se elimino el sobrante con una pipeta Pasteur sin tocar el centrifugado.
• Se volvió a añadir agua destilada hasta la marca de 15 ml y se centrifugo de nuevo por tres minutos. Se repitió el mismo procedimiento una vez más.

FIGURA 1. Enjuague de la muestra y limpieza.

Preparaciones permanentes en resina

• Con una pipeta Pasteur se introdujo aire cuidadosamente al centrifugado para separar los trozos unidos de muestra.
• Se añadió una gota de la muestra limpia sobre un portaobjetos y se coloco en la placa de calentamiento, se dejo secar por unos minutos o hasta eliminar completamente el agua.
• Se coloco una gota de resina sobre la muestra seca y se colocó el cubreobjetos.
• El portaobjetos se coloco en la parrilla y se retiro cuando la resina se esparció completamente.

RESULTADOS

Se obtuvieron 3 portaobjetos montados permanentemente con resina sintética Figura 2. Probablemente cuando estas muestras montadas sean vistas bajo el microscopio se puedan encontrar una gran variedad de diatomeas y silicoflagelados. Estos tipos de montajes nos sirven principalmente para observar con facilidad las características de los distintos organismos (taxonomía).

FIGURA 2. Muestras de diatomeas ya fijada.

DISCUSIÓN

La elección de un montante depende del tratamiento previo de las células y de un índice de refracción adecuado. Antes del montaje, la preparación debe haber sido sometida a un reactivo miscible con el montante. El medio de montaje debe tener un índice de refracción lo más diferente posible al de las células a visualizar. Las células de diatomeas tienen un índice de refracción de aproximadamente 1,15 y las células de dinoflagelado de I .21. A menudo es necesario calentar muy suavemente sobre una placa calefactora a aproximadamente 50 "a 70" C para eliminar las burbujas y producir un montaje duro (Soumina, A. 1978)

La elección del montante también depende si se quiere que la muestra sea permanente o semipermanente. En el caso de ser permanente se pueden utilizar diferentes tipos de resinas (polivino, epoxi, vinilo, polivinilo); este método es más complicado que el método semipermanente. En esta práctica se utilizo un tipo de resina sintética para montar las muestras.

 Si se quiere montar una muestra semipermanente el montante podría ser grenetina (grado bacteriológico); las ventajas de esta es la facilidad de realización, pero una desventaja sería la probable colonización de organismos ajenos a los que se quiere observar. Este tipo de montaje no se realizó en esta práctica.

CONCLUSIÓN

Los objetivos principales de esta práctica fue la limpieza de las muestras de diatomeas para su posterior fijación permanente en una resina sintética, esto con fines taxonómicos. Ya realizada la práctica se llegó a los resultados (muestras ya montadas) y se observó que se cumplieron los objetivos planteados.

REFERENCIAS  

•          Müller-Melchers, F. C., & Ferrando, H. J. (1956). Técnica para el estudio de las diatomeas. Boletim do Instituto Oceanográfico, 7(1-2), 151-160.

•          Hasle, G. R., & Fryxell, G. A. (1970). Diatoms: cleaning and mounting for light and electron microscopy. Transactions of the American Microscopical Society, 469-474.

•          Soumia, A. (1978). Phytoplankton manual. United Nations Educational, Scientific and Cultural Organization.

•          Lara-Villa, M. A., Moreno-Ruiz, J. L., & Amaro-Mauricio, E. J. (1996). Fitoplancton: Conceptos básicos y técnicas de laboratorio. México: Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.